Tout jeune homme, Javier Bardem apparaît dans plusieurs séries télévisées, joue au rugby dans l'équipe nationale espagnole, et traverse le pays avec une troupe de comédiens indépendants. Plus jeune membre d'une grande famille d'acteurs (il est le fils de la comédienne Pilar Bardem et le neveu du réalisateur Juan Antonio Bardem), il débute sur le grand écran dans Les Amours de Lulu de José Juan Bigas Luna en 1990, puis trouve son premier grand rôle dans Jambon Jambon du même réalisateur (1992), aux côtés de Penélope Cruz. Ce rôle très sexy lui procure une notoriété immédiate, jusqu'à l'élever au rang de sex-symbol. Il l'utilise bien malgré lui en tournant deux nouveaux films signés Bigas Luna en 1994 : Macho puis La Lune et le Teton.

Pedro Almodovar, qui lui avait déjà confié un petit rôle dans Talons aiguilles (1991), offre ensuite à Javier Bardem le rôle principal d'En chair et en os en 1998, après que ce dernier eut empoché le Goya (équivalent espagnol des Césars) du meilleur acteur pour Bouche à Bouche de Manuel Gomez Pereira (1995). Il semble qu'Almodovar ait alors retrouvé en Javier Bardem la fougue juvénile et la brutalité d'interprétation d'Antonio Banderas quelques années plus tôt.

Après avoir interprété un sexopathe amoureux de Victoria Abril dans Entre les jambes (1999), il joue sous la direction de Julian Schnabel dans Avant la nuit (2000), se glissant dans la peau de l'écrivain cubain Reinaldo Arenas, persécuté, censuré et emprisonné. Un rôle qui lui vaut une nomination à l'Oscar et au Golden Globe du Meilleur acteur, ainsi que la Coupe Volpi du meilleur acteur au Festival de Venise 2000.

Deux ans plus tard, l'acteur mène l'enquête dans Dancer upstairs, politique-fiction située en Amérique du Sud et première réalisation de John Malkovich. De retour devant la caméra d'un compatriote, il incarne en 2004 Ramon Sampedro, tétraplégique qui se battit 30 ans durant pour le droit à l'euthanasie, dans le quatrième long-métrage d'Alejandro Amenabar, Mar adentro. Sa prestation remarquable lui vaut quantité d'éloges. La cote de Javier Bardem monte en flèche et les Etats-Unis lui font de plus en plus les yeux doux au point de devenir, après Antonio Banderas, la nouvelle coqueluche hispanique du cinéma américain. L'acteur enchaîne ainsi les rôles marquants : inquisiteur repentis dans Les Fantômes de Goya de Milos Forman, riche armateur amoureux dans L'Amour au temps du choléra de Mike Newell, il est surtout le terrifiant et implacable tueur de Non, ce pays n'est pas pour le vieil homme des frères Coen.