Des peintres d'importance universelle tels que le Gréco, Ribera, Zurbarán, Vélazquez, Murillo, Goya, Van der Weyden, Bosch, Titien ou Rubens sont représentés par de nombreux chefs d'œuvre au Musée du Prado, l'un des plus riches du monde par la qualité et la variété de ses collections de peinture.

Isabel de Braganza, épouse du roi Fernando V, fut l'inspiratrice du Musée, ainsi que le rappelle la statue d'Alvarez Cubero installée dans l'une de ses salles. Elle est représentée aussi dans le portrait peint par Bernardo López, où l'on reconnaît l'immeuble et les plans du Musée (au Casón del Buen Retro).
Cependant la Reine mourut avant l'inauguration du Musée Royal de Peinture et de Sculpture, en 1819, après la réforme de l'immeuble construit en 1785 par Charles III et son architecte Juan de Villanueva pour y installer le Cabinet d'Histoire Naturelle et l'Académie des Sciences. Les rois espagnols, et en particulier Charles Quint, Philippe II et Philippe furent de grands collectionneurs d'art.

En fait, les premières oeuvres exposées dans le Musée procédaient des Collections Royales et dataient du XVIème siècle.
En 1870,on installa au Prado les collections du Musée de la Trinidad.
Les donations et les acquisitions postérieures ont considérablement enrichi les collections du Musée, d'une très grande importance par elle-mêmes, qui comprend à ce jour des peintures du XI au XIX siècle ; une collection de sculpture classique et moderne jusqu'au XIX siècle, ainsi que des dessins et des ouvrages d'arts décoratifs. Le Musée du Prado réunit, dans l'immeuble de Villanueva, la collection la plus complète du monde de peinture espagnole, du XI jusqu'au XVIII siècles.
La peinture et la sculpture du XIX siècle sont exposées au Casón del Buen Retiro, annexe au Musée du Prado.

Les œuvres les plus anciennes qui datent de la période romane (par exemple, les Fresques de San Baudelio de Berlanga, Soria et ceux de Santa Cruz de Maderuelo, Ségovie) et de la période gothique, comme le Christ bénissant, de Fernando Gallego et Saint Domingue de Silos, de Bartolomé Bermejo, ainsi que l'expression toute "léonardesque" de Sainte Catherine, une oeuvre de style Renaissance peinte par Yáñez de la Almedina, sont une excellente introduction avant d'arriver aux salles grandioses du Gréco, Velázquez et Goya.
Du peintre de Crète installé à Tolède, le Greco, on peut observer l'évidente influence de Michel Ange, avec la Trinité ; l'Adoration des Bergers, oeuvre de pleine maturité, offre une synthèse admirable du savoir faire et du style très personnel du peintre : rallongement des figures et violents contrastes de lumière. Parmi les portraits, le plus personnel, El Caballero de la mano en el pecho (Le Chevalier de la main à la poitrine) est le plus représentatif.